Эукариоты имеют оформленное ядро, содержащее ДНК. Размер типичной эукариотической клетки, например, клетки печени человека, составляет в поперечнике ~ 25 мкм. Ее ядро, размером ~ 5 мкм в диаметре, содержит 46 хромосом, суммарная длина ДНК которых равна 2 м. Эукариоты содержат значительно больше ДНК, чем прокариоты. Так, клетки человека и других млекопитающих содержат в 600 раз больше ДНК, чем в Е.coli. Общая длина всей ДНК, выделенной из клеток организма взрослого человека, составляет ~ 2 х 10 13 м или 2 х 10 10 км, что превышает окружность земного шара (4 х 10 4 км) и расстояние от Земли до Солнца (1,44 х 10 8 км).
Разработка методов одномолекулярной локализующей микроскопии позволила добиться точности локализации нанометрового масштаба внутри ячеек, что позволило разрешить ультратонкую клеточную структуру и выяснение важнейших молекулярных механизмов. Разработка одномолекулярной локализующей микроскопии, в частности для изображений с высоким разрешением, позволила исследователям визуализировать биологические процессы, происходящие в масштабе ниже дифракционного предела. Полученные локализации впоследствии могут быть восстановлены в изображение пуантилиста с пространственным разрешением, более чем в 10 раз превышающим масштаб широкополосной микроскопии.
У эукариот ДНК находится в хромосомах. В клетках человека 46 хромосом (хроматид), которые организованы в 23 пары. Каждая хромосома эукариотической клетки содержит одну очень большую молекулу двухцепочечной ДНК, несущую набор генов. Совокупность генов клетки составляет ее геном. Гены – это участки ДНК, которые кодируют полипептидные цепи и РНК.
Применение одномолекулярной микроскопии для понимания явлений, не обладающих какой-либо упорядоченной структурой, в основном ограничивалось прокариотами, используя их физические размеры с помощью таких методов, как полная флуоресцентная микроскопия внутреннего отражения.
Частично это связано с отсутствием определенных методов преодоления проблем, связанных с большей глубиной резкости. Он предоставляет исследователям возможность выполнять сложные генетические эксперименты с относительной технической легкостью одноклеточного организма, будучи более тесно связанными с людьми, чем прокариот.
Молекулы ДНК в 46 хромосомах человека не одинаковы по размеру. Средняя длина хромосомы составляет 130 млн. пар оснований и имеет длину 5 см. Понятно, что уместить такой длины ДНК в ядре возможно только путем ее определенной упаковки. При образовании третичной структуры ДНК человека происходит в среднем уменьшение ее размеров в 100 тысяч раз.
Каждая лазерная линия отображала четвертьволновую пластину и фильтр нижних частот. Оба лазерных луча были расширены и коллимированы с помощью встроенного расширителя пучка, состоящего из двух совпадающих линз и соединенного с использованием дихроичного зеркала.
Для разделения сигнала флуоресценции от лазерного излучения использовалось многодиапазонное дихроичное зеркало, полосовой фильтр и длинный фильтр. После инкубации клетки затем промывали три раза и ресуспендировали в ледяном фосфатном забуференном физиологическом растворе. Непосредственно перед изображениями клетки помещали на 1% агарозную подушечку и зажаты между двумя озонированными покровными стеклами, которые затем были запечатаны парафиновым воском.
Упаковка ДНК в эукариотических хромосомах отличается от ее упаковки в прокариотических хромосомах. Эукариотические ДНК имеют не кольцевую, а линейную двухцепочечную структуру. Кроме того, третичная структура ДНК у эукариотических клеток отличается тем, что многократная спирализация ДНК сопровождается образованием комплексов с белками. ДНК эукариот содержит экзоны - участки, кодирующие полипептидные цепи, и интроны – некодирующие участки (выполняют регуляторную функцию).
Моделирование создает изображение путем случайного позиционирования молекул и моделирования флуоресцентных выбросов фотонов и диффузии молекул в течение определенного времени с использованием настроенных интервалов. Шаги моделирования были интегрированы в заданное время экспозиции, позволяя диффузионным молекулам перемещаться в пределах одного выходного кадра. Каждый пиксель подвергался пуассоновскому шуму. Фоновый шум, интенсивность флуорофора и параметры мигания моделировались в соответствии с экспериментальными значениями, наблюдаемыми в наших оптимизированных условиях визуализации.
Эукариотические хромосомы состоят из хроматиновых волокон .
Эукариотические хромосомы выглядят как резко очерченные структуры только непосредственно до и во время митоза- процесса деления ядра в соматических клетках. В покоящихся, неделящихся эукариотических клетках хромосомный материал, называемый хроматином , выглядит нечетко и как бы беспорядочно распределен по всему ядру. Однако, когда клетка готовится к делению, хроматин уплотняется и собирается в хромосомы.
Нуклеазы и лигазы
Для каждого моделирования было смоделировано всего 500 молекул и случайным образом помещены в ограниченные сферические области диаметром 2 мкм, чтобы имитировать конфайнмент ядра деления дрожжей. Диффузионные молекулы моделировались в трех измерениях глубиной 2 мкм, подобно глубине дрожжевой клетки. Статические молекулы были моделированы в двух измерениях внутри удержания, чтобы имитировать статические молекулы в фокальной плоскости. Имитированные данные были снабжены нашими двумерными гауссовскими подпрограммами и результатами по сравнению с известными позициями моделирования.
Хроматин состоит из очень тонких волокон, которые содержат ~ 60 % белка, ~ 35 % ДНК, и, вероятно, ~ 5 % РНК. Хроматиновые волокна в хромосоме свернуты и образуют множество узелков и петель. ДНК в хроматине прочно связана с белками-гистонами, функция которых состоит в упаковке и упорядочении ДНК в структурные единицы – нуклеосомы. В хроматине содержится также ряд негистоновых белков. Хроматиновые волокна напоминают по внешнему виду нитки бус. Бусинки – это нуклеосомы .
Напомним, что одиночные молекулы измеряли, вычисляя процент молекул, которые были правильно локализованы, по меньшей мере, один раз в пределах 50 нм от истинного положения. Анализ с использованием отзыва всех локализаций показал аналогичные результаты.
Шум в изображении оценивался путем вычисления суммы различий каждого пикселя с четырьмя непосредственными соседями, разделенными на формирование остатка пикселя. Затем наименьшую половину квадратов остатков суммировали и использовали для оценки шума. Этот метод обеспечивал очень стабильную оценку шума независимо от количества пятен, присутствующих в данном кадре. Пики, появляющиеся в соседних кадрах в пределах порогового расстояния 800 нм, считались принадлежащими к одной и той же молекулярной траектории.
Нуклеосома состоит из белков-гистонов. Каждая нуклеосома содержит 8 молекул гистонов – по 2 молекулы Н2А. Н2В, Н3, Н4. Двухцепочечная ДНК обвивает нуклеосому дважды.
Нить ДНК намотана на гистоновое ядро нуклеосомы снаружи. В промежутках между нуклеосомами расположена соединительная нить ДНК, с которой связывается гистон Н1. Таким образом, нуклеосомы – это структурные единицы хроматина, выполняют функцию плотной упаковки ДНК. (ДНК укорачивается за счет того, что она обвивает гистоны). Хроматин связан также с негистоновыми белками ядра, которые образуют ядерный матрикс.
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия
Отдельные следы одиночных диффузионных белков, состоящие как минимум из четырех этапов, были сохранены для дальнейшего диффузионного анализа путем вычисления их среднего квадратического смещения. Поэтому мы моделировали трехмерное броуновское движение внутри сферы радиусом 1 мкм, чтобы получить более точный коэффициент диффузии внутри ядра. Число молекул в поле зрения было скорректировано так, чтобы было пригодно для анализа отслеживания одиночных частиц. Мы предположили, что существенных изменений в коэффициенте диффузии слитых белков не произойдет из-за почти одинаковых структур и молекулярных масс двух флуоресцентных репортеров.
Эукариотические клетки содержат также цитоплазматическую ДНК .
Кроме ДНК в ядре у эукариот есть ДНК в митохондриях . Хлоропласты фотосинтезирующих клеток также содержат ДНК. Обычно ДНК в цитоплазме составляет » 0, 1 % всей клеточной ДНК.
Митохондриальные ДНК – это двухцепочечные кольцевые молекулы малого размера.
Для всех экспериментов стеклянные слайды микроскопа были тщательно очищены перед использованием. Боросиликатные покровные стекла № 1 сначала озонировали в течение 30 мин, чтобы удалить следы аутофлуоресценции. Клетки помещали на 5% -ную агарозную подушечку, помещенную между двумя озонированными покровными стеклами, запечатанными парафиновым воском. Эксперименты проводились при 0 ± 5 ° С при малой мощности возбуждения 45 мкВт в образце, чтобы уменьшить эффект фотообесцвечивания во время эксперимента.
Для калибровки объема детектирования использовали раствор 10 нМ коммерческого флуоресцеина. Использование расширенного времени экспозиции позволило нам отделить флуоресцентный сигнал, возникающий от рассеивающих и неподвижных популяций: несвязанные белки, которые быстро диффундируют, излучают флуоресцентный сигнал из нескольких разделенных физических мест в образце в течение времени экспозиции каждого полученного кадра.
Молекулы ДНК в хлоропластах значительно больше, чем в митохондриях.
ДНК митохондрий и хлоропластов не связана с гистонами.
Для бактерий и сине-зеленых водорослей, которых принято причислять к классу прокариот (то есть доядерных живых организмов), характерно наличие бактериальной хромосомы. Это условное название, за которым скрывается единственная кольцевая молекула ДНК. Она имеется у всех клеток прокариот, располагается непосредственно в цитоплазме, не имея защитной оболочки.
При коротких временных интервалах ожидается, что флуоресценция от отдельных рассеивающих молекул появится как отдельная пункция и, следовательно, будет неотличима от статических молекул. Это не приведет к различию между стадией клеточного цикла. Однако, поскольку время экспозиции увеличивается, ожидается, что флуоресценция от рассеивающих молекул станет все более размытой.
Моделирование молекулярной диффузии для оптимизации времени экспозиции
Время, на которое визуализировались одиночные флуорофоры, составляло экспоненциальное распределение со средним временем 40 мс и 95-й процентиль локализаций, падающих на 97 мс. Уменьшение обнаружения связанных молекул при более высоких временах экспозиции, вероятно, будет связано с продолжающейся интеграцией фонового сигнала, ограничивая локализацию, обнаруженную выше фона, до небольшой популяции долгоживущих флуорофоров. Преимуществом дрожжей в качестве модельных эукариот является легкость, с которой можно провести сложные генетические эксперименты для выяснения важных взаимосвязей между функцией гена и фенотипом.
Особенности доядерных микроорганизмов
Как становится понятным из определения прокариот, основное качество их строения заключается в отсутствии ядра. Кольцевая молекула ДНК отвечает за сохранность и передачу всей информации, которая понадобится новой клетке, созданной в процессе деления. Структура цитоплазмы очень плотная и она неподвижна. В ней нет ряда органоидов, которые выполняют важные функции в :
Однако в будущем использование этих технологий будет основываться на разработке надежного методологического инструментария, который позволит непосредственно характеризовать и визуализировать конкретные явления. Однако нет априорной причины, почему метод не может быть распространен на других эукариот. Одним из ограничений нашего подхода является то, что, поскольку хроматин движется за время, затраченное на сбор данных, восстановленные снимки не предоставляют пространственную информацию о локализации белка в клетке в любой момент времени.
- митохондрий,
- лизосом,
- эндоплазматической сети,
- пластидов,
- комплекса Гольджи.
В цитоплазме хаотично расположены рибосомы, которые «заняты» на производстве белков. Немаловажной является миссия по производству энергии. Ее синтез происходит в митохондриях, но строение бактерий исключает их наличие. Поэтому функцию данных органоидов взяла на себя именно цитоплазма.
Действительно, выход в основном ограничивается количественным измерением, которое представляет собой хроматин-ассоциированную фракцию белка, которая может быть интерпретирована только между двумя или более конкретными условиями. Все авторы внесли свой вклад в разработку экспериментов. Б. провел эксперименты с микроскопом. Е. проанализировал номера локализации, восстановил изображения с высоким разрешением и выполнил моделирование. Б. выполнил одночастичный анализ слежения. Г. спроектировал и построил микроскоп.
Структуры на концах хромосом
† Авторы хотели бы знать, что, по их мнению, первые два автора следует рассматривать как совместные первые авторы. Финансирование платы за открытый доступ: Европейский исследовательский совет. Конфликт интересов. Получение внутриклеточных флуоресцентных белков с разрешением нанометра. Сверхвысокое разрешение с помощью флуоресцентной фотоактивационной микроскопии локализации.
Геном микроорганизмов
Процесс самовоспроизведения, во время которого происходит копирование важных данных из одного источника на другой, называют репликацией. Результатом этого действия (свойственного в том числе и для клеток бактерий) является создание себе подобной структуры. Участниками репликации (репликонами) у прокариотов считаются:
Компоненты прокариотических клеток
Прокариот - это простой, одноклеточный организм, в котором отсутствует организованное ядро или другая связанная с мембраной органелла. Описать структуру прокариотических клеток. Все ячейки имеют четыре общих компонента. Общая структура прокариотической клетки. На этом рисунке показана обобщенная структура прокариотической клетки. Другие показанные структуры присутствуют в некоторых, но не во всех, бактериях.
Однако прокариоты отличаются от эукариотических клеток несколькими способами. Прокариот - это простой, одноклеточный организм, в котором отсутствует организованное ядро или любая другая мембраносвязанная органелла. Вскоре мы увидим, что это значительно отличается у эукариот.
- кольцевая молекула ДНК,
- плазмиды.
Вообще, одна хромосома способна нести в себе около 1000 известных генов.
Плазмиды
Еще одним репликоном прокариот являются плазмиды. У бактерий они представляют собой молекулы ДНК, имеющие строение в виде двух цепочек, замкнутых в кольцо. В отличие от бактериальной хромосомы они отвечают за кодирование тех «умений» бактерии, которые помогут ей выжить, если вдруг она окажется в неблагоприятных условиях для существования. Они могут автономно воспроизводить себя, поэтому в цитоплазме может быть несколько копий плазмид.
Большинство прокариотов имеют клеточную стенку пептидогликана, и многие из них имеют полисахаридную капсулу. Клеточная стенка действует как дополнительный слой защиты, помогает клетке поддерживать свою форму и предотвращает обезвоживание. Капсула позволяет клетке прикрепляться к поверхностям в окружающей среде. Некоторые прокариот имеют жгутики, пили или фимбрии. Пили используются для обмена генетическим материалом во время размножения, называемого конъюгацией. При диаметре от 1 до 0 мкм прокариотические клетки значительно меньше, чем эукариотические клетки с диаметром от 10 до 100 мкм.
Трансмиссивные репликоны способны передаваться из одной клетки в другую. Они несут в своей кольцевой молекуле ДНК некоторые признаки, которые причисляют к категории фенотипических изменений:
- выработка устойчивости к антибиотикам;
- способность продуцировать колицины (белковые вещества, способные уничтожать микроорганизмы того же рода, что послужили источником их возникновения);
- переработка сложных органических веществ;
- синтез антибиотических веществ;
- способность проникать в организм и вызывать заболевания;
- возможность преодолевать защитные механизмы, размножаться и распространяться в организме;
- умение вырабатывать токсины.
Последние три «навыка» называют факторами патогенности, знания о которых содержит в себе кольцевая молекула ДНК плазмид. Именно благодаря этим факторам болезнетворные бактерии становятся опасными для человеческого организма.
Небольшие размеры прокариотов позволяют ионам и органическим молекулам проникать в них, чтобы они быстро диффундировали в другие части клетки. Аналогично, любые отходы, образующиеся в прокариотической клетке, могут быстро диффундировать. Это не относится к эукариотическим клеткам, которые разработали различные структурные адаптации для улучшения внутриклеточного транспорта.
Размер микроорганизмов: на этом рисунке показаны относительные размеры микробов по логарифмической шкале. Малый размер, в общем, необходим для всех клеток, будь то прокариотический или эукариотический. Во-первых, мы рассмотрим площадь и объем типичной ячейки. Не все клетки имеют сферическую форму, но большинство склонны приближать сферу. Таким образом, по мере увеличения радиуса ячейки его площадь поверхности увеличивается как квадрат ее радиуса, но его объем увеличивается как куб его радиуса. Следовательно, по мере увеличения размера ячейки ее отношение площади поверхности к объему уменьшается.
Таким образом, кольцевая молекула ДНК, имеющаяся у всех прокариот, одна несет в себе целый комплекс навыков, полезных для их выживания и жизнедеятельности.