Клеточные технологии в селекции растений . Обогащение генофонда зерновых культур может быть достигнута при использовании огромных генетических ресурсов их дикорастущих сородичей. Найдены виды злаков с высокой устойчивостью к:
- болезням и вредителям,
- температурным и водным стрессам,
- засолению и высокой кислотности почв.
В селекционной работе для преодоления межвидовой (или даже межродовой) несовместимости применяют методы:
- оплодотворения in vitro,
- культуру зародышей,
- возвратные скрещивания и другие современные приемы (Feldman, Sears, 1984).
Генная инженерия растений создает совершенно новый механизм генетической изменчивости - трансгеноз , который в отличие от ранее существовавших (рекомбиогенез, мутагенез) характеризуется возможностью переноса отдельных генов. Правда, эта особенность затрудняет применение методов генной инженерии для улучшения ряда хозяйственно ценных признаков, наследуемых полигенно. Но уже получены химерные растения, несущие гены устойчивости к болезням, насекомым, гербицидам и др. (Кильчевский, Хотылева, 1997).
Отдаленная гибридизация культурных злаков с дикорастущими сородичами имеет целью перенос единичных генов или небольших фрагментов хромосом от дикорастущих в геном культурных видов. Но для этого необходимо преодолеть барьер несовместимости - отсутствие конъюгации хромосом в мейозе. У пшеницы в хромосоме 5В были обнаружены гены, влияющие на конъюгацию хромосом, и, таким образом, выявлена возможность в определенной степени управлять этим процессом.
В Мадридском университете (Испания) и Институте селекции общества Макса Планка (Кельн, ФРГ) для озимой ржи разработан метод прямого переноса генов , позволяющий получать трансгенные растения относительно простым способом in vivo, исключающим необходимость регенерации растений из клеточных. Наиболее широко работы ведутся с бактериями Azospirillum (Postgate, 1989). В серии опытов, проведенных в различных штатах Индии, инокуляция семян пшеницы, риса, сорго, проса ризосферными азотфиксаторами обеспечивала прибавки урожая зерна до 30% (Subba Rao, 1982.
Более широкое практическое применение в настоящее время получило другое важнейшее направление современной биотехнологии - клеточная селекция как метод создания новых форм растений путем выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций в селективных условиях. Клеточная селекция является как бы развитием мутационной селекции, но реализуется на уровне единичных клеток с использованием техники in vitro, что придает ей, с одной стороны, более широкие возможности, а с другой стороны - создает значительные трудности из-за необходимости регенерации из отдельных клеток полноценных растений.
Преимущество клеточной селекции перед традиционными методами состоит в:
- отсутствии сезонности в работе,
- возможности использования миллионов клеток при отборе,
- направленности селекции путем применения селективных сред,
- выполнении работ в лабораторных условиях
С развитием культуры in vitro появилась реальная возможность более широкого использования гаплоидии в селекции сельскохозяйственных культур. Применение метода культуры клеток позволило осуществить регенерацию растений из генеративных клеток, содержащих гаплоидный набор хромосом. Стало возможным массовое получение гаплоидов. Практическое значение в селекции в настоящее время получили культура пыльников (андрогенез), завязей и семяпочек (гиногенез) и метод гаплопродюсера , который является разновидностью гиногенеза
На данный момент большую роль в развитии растениеводства играет использование достижений генной инженерии и биотехнологии. Существует ряд мнений, биотехнология и генетически модифицированные растения на современном этапе выращивания растениеводческой продукции позволят решить экологические, энергетические и продовольственные проблемы, стоящие перед человечеством, посредством создания и использования новых организмов, продуктов, полученных с помощью методов генной инженерии, культуры органов и тканей in vitro и др.
Биотехнология и генная инженерия - науки, смотрят в будущее человечества...
Современная биотехнология растений - сумма технологий, развитые с молекулярной и клеточной биологии растений - является новой стадией в развитии технологии селекции растений. С ее помощью улучшения признаков может проходить на уровне индивидуального гена. Отдельные гены, которые определяют определенный признак, могут быть идентифицированы, изолированы, введенные, исключены или модифицированы в генотипе или сорте растения, за ними может проводиться отбор.
Вклад биотехнологии в растениеводство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений, разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельскохозяйственного производства. Методами генной и клеточной инженерии созданы высокопроизводительные и устойчивые против вредителей, болезней и других негативных факторов сорта сельскохозяйственных растений. Разработанная техника оздоровления растений от инфекций, что особенно важно для культур, которые размножаются вегетативно. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков, разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты последних от вредителей и болезней, бактериальные удобрения. Одним из актуальных вопросов биотехнологии является управление процессами азотфиксации и фотосинтеза, возможность введения соответствующих генов в геном культурных растений.
На современном этапе развития для интенсификации селекции эффективно использование таких биотехнологических методов: культура изолированных тканей, клеток и органов растений, клеточная селекция и генная инженерия. Они дают возможность за короткий срок создать и размножить ценный исходный высокопроизводительный материал, гетерозисных гибриды и сорта сельскохозяйственных растений. Разработка основ метода культуры тканей растительных организмов имеет сравнительно короткую историю и начинается с исследований, выполненных Габерландт в 1902 году. Однако каждое открытие, сделанное в этой области, нашло применение в прикладных исследованиях. Все проблемы, которые решаются в культуре in vitro, можно разделить на три основные группы:
1) сохранение генетической информации клеток (микроклональное размножения и депонирование, культура зародышей, пыльников и семенных зачатков)
2) изменение генетической информации путем мутагенеза под влиянием физических и химических факторов (культура каллуса, суспензий, протопластов)
3) перенос и интеграция генетической информации (генно инженерное конструирование растений с новыми признаками, соматическая гибридизация).
Основные направления развития биотехнологии в растениеводстве: 1) повышение содержания белка и незаменимых аминокислот в продукции сельскохозяйственных растений, достигается созданием так называемых генетически модифицированных организмов (ГМО), прежде всего трансгенных растений. Они приобретают хозяйственно-ценных признаков, в результате переноса генов, которые предопределяют, в частности от бактерий. Приоритетным признано вывода азотфиксирующих сортов зерновых культур; 2) получение бактериальных удобрений (азотфиксирующих бактерий), биопестицидов; 3) создание сортов и гибридов культурных растений, устойчивых к болезням, вредителям. Так, в США выращивают растения томатов, картофеля, хлопчатника, что приобрели устойчивость к насекомым; растения томатов, картофеля, устойчивые к патогенным вирусам. Получены сорта растений, устойчивых к гербицидам сплошного действия, что значительно облегчает борьбу с сорняками и удешевляет технологию выращивания, поскольку исчезает необходимость в применении селективных гербицидов.
Следует отметить, что среди ученых нет единодушия относительно возможного эффекта исследований по генной инженерии, влияния их на здоровье и безопасность человека, а также на функционирование экологических систем.
Существуют крайние взгляды, согласно которым биотехнология должна быть запрещена, поскольку знания о ней недостаточны для обеспечения полной безопасности человека. Высказывается и противоположное мнение: применение генной инженерии безопасное и требует минимального контроля. При этом основным аргументом является то, что принципиального различия между генной инженерией и селекцией нет. К тому же при генной инженерии выполняются известные, заранее спланированные модификации, а скорость процесса выше.
Свидетельством высоких темпов развития биотехнологии является, в частности, то, что в 1997г. В США и Канаде трансгенные кукурузу, сою, рапс, сахарная свекла выращивали на миллионах гектаров. Трансгенная соя только в США занимала 12%, кукуруза - 6, хлопчатник - 13% всех посевных площадей этих культур.
По заключению экспертов ФАО, в 2030 г.. Весь прирост производства продукции растениеводства будет достигнуто за счет новых сортов растений.
Ведущее место в биотехнологических исследованиях заняли корпорации "Дюпон", "Новартис", "Монсанто", "Рон-Пуленк", "Карсил".
Генетическая инженерия открывает перед селекцией растений новые перспективы, возможность переноса в них генов от бактерий, грибов, экзотических растений и даже человека и животных, в том числе и генов устойчивости, является недостижимым для экспериментального мутагенеза и традиционной селекции. Революционным свершением в генетической трансформации растений стало обнаружение природного вектора - агробактерий для переноса генов и разработка метода микробомбардування растительных объектов микрочастицами металлов с предварительно нанесенной чужеродных ДНК. Три выдающиеся достижения физиологии растений создали основу для интеграции технологии рекомбинантных ДНК в генно-инженерную биотехнологии растений. Во-первых, открытие фитогормонов, которые регулируют рост и развитие растений. Во-вторых, разработка методов культивирования клеток и тканей растений in vitro (эти методы дали возможность выращивать клетки, ткани и целые растения в стерильных условиях и проводить их селекцию на селективных средах). Потро, установление феномена тотипотентности соматических растительных клеток, который открыл путь к регенерации из них целых растений.
На сегодняшний день генетическая инженерия сельскохозяйственных растений развивается преимущественно в русле классической селекции. Основные усилия ученых сосредоточены на защите растений от неблагоприятных (биотических и абиотических) факторов, улучшении качества и уменьшении потерь при хранении продукции растениеводства. В частности, это повышение устойчивости к болезням, вредителям, заморозков, солонцеватости почвы и т.д., удаление нежелательных компонентов из растительных масел, изменение свойств белка и крахмала в пшеничной муке, улучшения лежкости и вкусовых качеств овощей и др. По сравнению с традиционной селекцией, основными инструментами которой являются скрещивания и отбор, генная инженерия дает возможность использования принципиально новых генов, которые определяют агрономически важные признаки, и новых молекулярно-генетических методов мониторинга трансгенов (молекулярные маркеры генов), что во много раз ускоряют процесс создания трансгенных растений. Селекционеров привлекает возможность целенаправленного генетического "ремонта" растений. Важным направлением является создание генетически модифицированных растений (ГМР) с признаком мужской стерильности. Кроме того, благодаря генетической модификации растения могут выполнять не свойственную им ранее функцию. Примером является корнеплоды сахарной свеклы, которые накапливают вместо сахарозы низкомолекулярные фруктами, бананы, которые используют как съедобную вакцину. Благодаря введению генов бактерий высшие растения приобретают свойства разрушать чужеродные органические соединения (ксенобиотики), загрязняющих окружающую среду. Выращивание ГМР, устойчивых к широкому спектру болезней и насекомых-вредителей, может существенно снизить, а в дальнейшем свести к минимуму пестицидную нагрузки на окружающую среду.
При рассмотрении проблемы возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду обсуждаются в основном такие основные аспекты:
Сконструированы гены будут переданы с пыльцой близкородственными диким видам, и их гибридное потомство приобретет свойства повышенной семенной продуктивности и способность конкурировать с другими растениями;
Трансгенные сельскохозяйственные растения станут сорняками и вытеснят растения, которые растут рядом;
Трансгенные растения станут прямой угрозой для человека, домашних и диких животных (например из-за их токсичности или аллергенности).
Еще одним важным аспектом является получение трансгенных растений с лучшей способностью использовать минеральные вещества, что, кроме усиления их роста, будет препятствовать смыва таких соединений в грунтовые воды и попадание в источники водоснабжения.
Гарантией против нежелательных последствий генетической модификации растений является законодательное регулирование распространения ГМР и разработка связанных с этим методов оценки экологического риска. Кроме того, значительная внимания уделяется достаточное информированности агрономов, селекционеров, СЕМЕНОВОД, потенциальных покупателей об особенностях продуктов из генетически модифицированных растений. В Украине и ряде других стран приняты законы, которые предупреждают несанкционированное распространение трансгенных семенного материала, обеспечивающего мониторинг в посевах, а также маркировки пищевых продуктов, изготовленных из продуктов ГМР или их добавлением.
В Украине законодательно не разрешено выращивать генетически модифицированные сорта. Это, возможно, одно из правильных решений, которое было принято в области аграрной политики. Будет большой ошибкой для Украины переход к выращиванию ГМ-сортов уже сейчас. Есть еще много нереализованных резервов роста урожайности за счет технологических мероприятий. Не вдаваясь в дискуссию о вреде или безвредности генетически модифицированных сортов, следует отметить, что они для Украины еще не время, потому что не будут способствовать ни росту урожайности, ни улучшению экономических показателей. Только создадут проблему с выходом сельскохозяйственной продукции на мировой рынок, снизят ее цену и возможность реализации.
Биотехнология - важный, но не единственный элемент научно-технического прогресса в аграрном секторе, поэтому необходим комплексный подход к этому вопросу с учетом альтернативных технологий. Одним из таких направлений развития является органическое земледелие.
Плодородие почвы создает " живое вещество " , которая состоит из миллиардов почвенных бактерий, микроскопических грибков, червей и других живых организмов. Переделывая органические растительные остатки и минеральные вещества, бактерии обеспечивают питание червей, которые существенно улучшают структуру и плодородие грунта.
Суть плодородия почв заключается в "" кормления бактерий и других живых существ ", которые живут в фунте. Необходимо накормить сначала микробов и червей, а они, в свою очередь, накормят растения. Ни минералы, ни органика, сами по себе не переходят в усваиваемую форму. Эту функцию выполняют жители фунтов, о которых и необходимо заботиться в первую очередь. Такая постановка вопроса в проблеме фунтов требует от агрономов изменения фадицийного мышления, отказа от глубокой отвальной вспашки. Интенсивная химизация полей уничтожила микрофлору и животных фунт сообщества, которые являются основными воспроизводителями плодородия грунта.
Почвы, в которых преобладают анабиотических или регенеративные микроорганизмы, является исключительно плодородными. Растения, выросшие на таких фунтах, прекрасно развиваются, они здоровые, устойчивые к болезням и вредителям. Такие фунты без всяких химикатов, пестицидов и искусственных удобрений демонсфують постоянное увеличение плодородия. Если же в фунте преобладают дегенеративные или патогенные микроорганизмы, развитие растений ослаблен, они не устойчивы к различным заболеваниям и вредителям и требуют допинга в виде искусственных удобрений и пестицидов. К сожалению, такой деградировавший, истощенное состояние фунтов имеет тенденцию к расширению даже в странах с высоким уровнем агротехнологий. Интенсивная химизация полей, применение пестицидов и искусственных удобрений, вместе с тяжелым сельскохозяйственным оборудованием, уничтожают микрофлору грунта.
Практика показала, что улучшить питательный режим фунтов, преодолеть вредителей и болезни сельскохозяйственных культур массовым применением химических средств не удается. В естественных, здоровых агроценозах растение живет в окружении полезных микроорганизмов, и только они способны воспроизводить среду, поддерживать нужный для комфортного существования живых существ баланс питательных веществ, а значит - максимально реализовывать потенциал урожайности.
Кроме экологических факторов влияют и чисто экономические: производство и внесения удобрений и СЗР пофебуе значительных энергозатрат. К примеру, в развитых странах на производство азотных удобрений вифачають почти фетину энергии, потребляемой в сельском хозяйстве. Не меньшую проблему представляет и дефицит сырья для производства фосфорных удобрений, обусловливает их высокую стоимость.
Поэтому в мире популяризируются идеи биоорганической земледелия, при котором применение химических удобрений и пестицидов допускается минимально или совсем не допускается. Сейчас мировой рынок биотехнологий для сельского хозяйства и пищевой промышленности оценивается почти в 50 млрд. Американских долларов и ежегодно растет на 20-30%.
Нужно учитывать тот факт, что генетически модифицированные сорта до сих пор почти не выращивают в Европе. Есть только экспериментальные посевы на площади 1-3 тыс. Га. Только в Испании отведено площади до 100 тыс. Га. Но это незначительное количество общей пашни в Европе (В. В. Лихочвор, 2001 и 2006).
План лекции
Тема 5,6. Препарат для сельского хозяйства. Белок одноклеточных микроорганизмов
ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ
МОДУЛЬ 2.
Форма проведения лекции: мозговая атака
1 Биотехнология и растениеводство.
2 Биотехнология и животноводство.
3 Технологическая биоэнергетика.
4 Производство кормового белка.
5 Использование дрожжей и бактерий.
6 Использование водорослей и микроскопических грибов.
Проблема для решения: области применения биотехнологии в сельском хозяйстве.
Студенты высказывают идеи для решения этой задачи. Затем идеи анализируются группой экспериментов при помощи и консультировании преподавателя. Правило мозговой атаки – высказываются любые идеи вплоть до самых абсурдных, запрещается критика идей в момент атаки. Все идеи записываются ведущим, и обеспечивается их обозрение участниками. Такая лекция активизирует мыслительную деятельность студентов, развивает эвристические способности.
Культурные растения страдают от сорняков, грызунов, насекомых-вредителей, нематод, фитопатогенных грибов, бактерий, вирусов, неблагоприятных погодных и климатических условий. Перечисленные факторы наряду с почвенной эрозией и градом значительно снижают урожайность сельскохозяйственных растений. Огромный ущерб в картофелеводству наносят колорадский жук, а также гриб Phytophtora -возбудитель ранней гнили (фитофтороза) картофеля.
Кукуруза подвержена опустошительным «набегам» южной листовой гнили, ущерб от которой в США в 1970 г. был оценён в 1 млрд. долларов.
В последние годы большое внимание уделяют вирусным заболеванием растений. Наряду с болезнями, оставляющими видимые следы на культурных растениях (мозаичная болезнь табака и хлопчатника, зимняя болезнь томатов), вирусы вызывают скрытые инфекционные процессы, значительно снижающие урожайность сельскохозяйственных культур и ведущие к их вырождению.
Биотехнологические пути защиты растений от рассмотренных вредоносных агентов включают:
Выведение сортов растений, устойчивых к неблагоприятным факторам;
Химические средства борьбы (пестициды), с сорняками (гербициды), грызунами (ратициды), насекомыми (инсектициды), нематодами (нематоциды), фитопатогенными грибами (фунгициды), бактериями, вирусами.;
Наряду с защитой растений ставится задача повышения продуктивности сельскохозяйственных культур, их пищевой (кормовой) ценности, создание сортов растений, растущих на засоленных почвах, в засушливых и заболоченных районах. Разработки нацелены на повышение энергетической эффективности различных процессов в растительных тканях, начиная от поглощения кванта света и кончая ассимиляцией СО 2 и водно-солевым обменом.
Основная задача биотехнологии в растениеводстве – это получение стабильно высоких урожаев и обеспечение населения экологически чистой продукцией. Без применения современных методов биотехнологии невозможно решить проблему продовольственной безопасности региона. Не случайно повышение урожайности возделываемых на территории губернии культур, прежде всего зерновой группы, является одной из важнейших задач, поставленных перед АПК региона губернатором Самарской области Николаем Меркушкиным. Помочь в этом деле в том числе и биотехнологии, разработанные НВП «БашИнком».
Результаты 20-летних полевых испытаний на территории России и совместной работы со многими научными учреждениями страны показали: применение биопрепаратов производства НВП «БашИнком» повышает урожайность сельхозкультур на 18-40%, при этом снижается себестоимость полученной продукции, улучшается её качество. Аграрной практикой неоднократно доказана эффективность применения биотехнологии антистрессового высокоурожайного земледелия (АВЗ) при обработке посевов различных культур даже в неблагоприятные по климатическим условиям годы.
В комплексном применении препаратов и заключается суть АВЗ-технологии и новизна разработок компании «БашИнком» из Уфы. В их числе - препараты серии Гуми и Фитоспорин. Данные препараты используют не только как антистрессовые, иммуно - и ростостимулирующие препараты для растений и в качестве биофунгицида, но и как своеобразные мобилизаторы почвенной кладовой питательных веществ.
Биопрепараты в «Спектре»
Например, как рассказал главный агроном управления сельского хозяйства Пестравского района Самарской области Александр Блинков, в июне 2012 года в одном из местных сельхозпредприятий препаратом ГУМИ-20М «Богатый» и комплексным биоактивированным удобрением «Бионекс-КЕМИ» были в экспериментальном порядке обработаны 30 гектаров посевов яровой пшеницы сорта «золотистая». Первый из них применялся для ускорения роста и защиты посевов от погодных, гербицидных и других стрессов. Второй биопрепарат предназначался для внекорневой азотной (с микроэлементами) подкормки с усиленными антистрессовыми, иммуностимулирующими и фунгицидными свойствами.
Поля принадлежат, руководитель которого Александр Кишков решил апробировать продукцию известной башкирской фирмы-производителя. В результате прибавка урожайности на обработанных посевах составила 4 с небольшим центнера с гектара. Много это или мало? В Пестравском районе, расположенном практически на самом юге региона, острый дефицит летних осадков - обычное явление. 2012-й исключением не стал, но тем не менее с одного гектара посевов, где применили биопрепараты производства НВП «БашИнком», здешние земледельцы намолотили 12 центнеров зерна. Для сравнения: по данным, полученным от агронома хозяйства Алексея Каюрова, на расположенном рядом поле с посевами аналогичной культуры, но не обработанной биопрепаратом, средняя урожайность оказалась на уровне 8 ц/га. Причём на обработанном биопрепаратами поле зерно нового урожая оказалось 2-го класса, а на необработанных посевах - только 3-го класса. В на собственном примере убедились: применение биотехнологии позволило полнее раскрыть заложенный в яровой пшенице «золотистая» биологический потенциал.
С учётом сложившейся на рынке цены на отвечающее всем необходимым требованиям яровое зерно продовольственного класса в размере 8 тыс. рублей за тонну полученная прибавка урожая позволила получить хозяйству дополнительный доход. Затраты на один гектар составили 275 рублей, а хозяйство получило дополнительно с каждого гектара 3100 рублей. Иными словами, на каждый вложенный рубль в «Спектре» получили 10 рублей прибыли. По мнению главного агронома райуправления, это позволяет рассчитывать на то, что в текущем году руководители растениеводческих хозяйств района смогут тиражировать полученный результат на своих полях.
Главный агроном управления сельского хозяйства Пестравского района
Александр Блинков и агроном Алексей Каюров на опытном
участке посевов, обработанных биопрепаратами
Опыт регионов
Система антистрессового высокоурожайного земледелия (АВЗ) от НВП «БашИнком» успешно внедряется в ряде регионов России.
Так, в Курганской области в годах эффективность биопрепаратов производства НВП «БашИнком» исследовал профессор (Курганский НИИСХ). По его данным, на протяжении всех лет исследований биопрепараты показали высокую эффективность. В 2012 году он провел испытания биофунгицида Фитоспорин-МЖ на посевах яровой пшеницы. В опыте провели обработку семян Фитоспорином-МЖ (1 л/т) плюс обработка посевов в фазу флаг-лист Фитоспорином-МЖ 1,5 л/га.
В результате получен урожай яровой пшеницы 11,2 ц/га, тогда как на близлежащем поле без обработки - только 7,7 ц/га. Таким образом, прибавка урожая составила 3,5 ц/га, или 45%.
Аналогичные опыты в 2012 году проведены в Нижегородской области специалистами ФГУ «Россельхозцентр», где получены следующие результаты. При возделывании яровой пшеницы по биотехнологии (АВЗ) средняя урожайность составила 28,2 ц/га, тогда как по традиционной технологии - 22,6 ц/га. Прибавка урожая яровой пшеницы составила 5,6 ц/га, или 25%.
Более 10 лет эффективность биопрепаратов производства «БашИнком» на различных сельхозкультурах изучают во Всероссийском НИИ биологической защиты растений (г. Краснодар). Учёными института также доказана их высокая эффективность как в повышении урожайности, так и в защите растений от комплекса грибных и бактериальных заболеваний.
Таким образом, применение в производстве растениеводческой продукции биотехнологии (АВЗ) обеспечивает:
· увеличение урожайности - на 15-30%;
· комплексную защиту от болезней;
· снижение затрат на защиту растений - в 1,5-2 раза;
· защиту растений от стрессов, включая «гербицидную яму»;
· снижение дозы минеральных удобрений - до 30%;
· снижение зависимости от погодноклиматических условий;
· повышение плодородия почвы;
· 1 рубль затрат на биопрепараты дает от 3 до 45 рублей чистой прибыли.
Юрий СКУДАЕВ,
ГБУ «Самара-АРИС»
Петр КУЗНЕЦОВ,
региональный представитель НВП «БашИнком», т. 2-15
Особое направление применения клеточных культур и клеточных технологий - тканевая инженерия, связанная с разработкой биоискусственных органов и тканей. В настоящее время на базе накопленных фундаментальных знаний освоены, включая промышленные масштабы, технологии ведения клеточных культур различного происхождения (растительных клеток, клеток насекомых и млекопитающих).
Растительные клетки и культура растительных тканей позволяют регенерировать целое растение из протопластов и клеток. Особенностью клеточных культур растений является их способность к тотипотенции, т.е. в определенной среде и определенных условиях можно регенерировать целое растение из одной клетки. Эта техника обеспечивает за сравнительно короткий срок получение в контролируемых условиях многочисленных популяций клеток и дает возможность идентифицировать линии растений с повышенной биологической продуктивностью.
Клеточная инженерия растений базируется на использовании культуры изолированных клеток, тканей, протопластов. Существует несколько направлений использования этих технологий в растениеводстве.
Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать в культуре ценные биологически активные соединения, в том числе женьшеня или идиолитов, эфирных масел, алкалоидов, глюкозидов и др.
Второе направление - это использование культуры изолированных тканей для клонального размножения растений и оздоровления посадочного материала.
Третье направление - это применение изолированных клеток в селекции растений. Культивируемые на искусственных средах растительные клетки характеризуются большой неоднородностью; при этом возможен отбор клеток, устойчивых к тем или иным неблагоприятным факторам - засухе, низкой температуре, фитопатогенам и пр.
Культуры растительных клеток используют для биотрансформации химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных соединений de novo. В культуре клеток сохраняется способность продуцировать биологически активные соединения, свойственные исходному целому растению, что позволяет организовать условия, обеспечивающие синтез ценных продуктов, ранее не обнаруженных в исходных интактных растениях. Например, в культурах растительных клеток стало возможным получать такие ценные соединения, как перицин, перикалин, хинокиол, ферригинол, акуаммалин и др.
Реализованы крупномасштабные культивационные системы растительных клеток для получения различных ценных веществ - ментола, женьшеня, убихинона-10, бетанина, камптотецина (антиканцероген), полипептидов - ингибиторов фитовирусов, агар-агара и др. Например, эффективный и дорогостоящий цитостатический препарат паклитаксель, традиционно получаемый из коры Тиса среднеземноморского (8 т исходного сырья обеспечивают получение 1 кг препарата), в настоящее время с большей эффективностью получают в культуре клеток.
Еще более эффективными оказались процессы с использованием иммобилизованных растительных клеток. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные культивационные условия. После установления способности апикальной меристемы (небольшой участок недифференцированных клеток на кончике стебля) к росту с образованием целого растения, эта техника стала применяться для клонирования линий растений.
Культура растительных тканей, аналогично культуре клеток, позволяет достаточно быстро получать здоровые растительные клоны и на этой основе - перспективный посадочный материал практически в неограниченных масштабах.
Культуры клеток насекомых дают возможность получать биологические агенты новых типов для борьбы с насекомыми-вредителями без негативного влияния на жизнеспособность полезных видов насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Достоинства биологических методов борьбы с вредителями известны уже давно, это бактериальные, грибные и вирусные препараты, получение которых требует специализированной техники и условий. Особенно это характерно для препаратов вирусной группы, производство которых основано на массовом размножении насекомого-хозяина на искусственных средах. Вследствие достаточной трудоемкости производства эти препараты до недавнего времени не находили массового применения.
Использование культур клеток насекомых способно полностью решить эту проблему. Техника клеточных культур насекомых для размножения вирусов весьма перспективна. Для этого необходимо получение высокопродуктивных линий клеток, оптимизация питательных сред, выбор эффективных систем «вирус - клетка». По этой технологии в США производят препарат «Элькар». Весьма успешны разработки по рекомбинантным бакуловирусам с генами, кодирующими водный обмен насекомых. После применения такого препарата насекомые погибают в течение 5 дней от обезвоживания либо перенасыщения водой.
Новые методы биотехнологии могут повлиять на цену вирусных препаратов. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Начата реализация использования потенциала клеток насекомых для производства VLP-вакцин (VLP - virus-like particle - вирусоподобные частицы), предназначенных для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца.
Культуры клеток животных широко используют в качестве тест-объектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме этого, клетки млекопитающих пригодны для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов, а также моноклональных антител и вакцин.
Например, компанией Sanofi Pasteur (США) по заказу Министерства здравоохранения и социальных услуг США разрабатываются методы культивирования клеток млекопитающих с целью эффективного синтеза вакцин против гриппа. Особое направление применения клеточных культу, в особенности стволовых клеток, и технологий - терапия и реконструктивная хирургия поврежденных органов и тканей.
Перечень болезней, лечение которых становится возможным благодаря использованию клеточной терапии и трансплантологии, быстро пополняется. Наиболее продвинутым в настоящее время является применение клеточных технологий в кардиологии для лечения инфаркта миокарда, восстановления кровотока в ишемизированных органах и тканях, повышения насосной функции сердца, а также лечения дислипидемий и атеросклероза. В неврологии трансплантационные клеточные технологии начали применять для лечения болезни Паркинсона и болезни Хагинтона.
Имеются примеры положительного использования стволовых клеток костного мозга для заживления ожоговых и глубоких кожных ран, лечения системных и местных костных дефектов. В связи с выявленной противоопухолевой активностью низкодифференцированных кроветворных клеток и их способностью прямо супрессировать опухолевый рост проводятся исследования, направленные на клиническое применение стволовых клеток в онкологии.
Поиск новых технологий для восстановления утраченной функции органа или системы привели к появлению на стыке биотехнологии и медицины тканевой инженерии (регенеративной медицины и органогенеза). Будущее медицины напрямую связывают с развитием клеточных технологий, которые позволяют, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его клеточный состав. Такое «обновление» структурно-функциональных элементов органа дает возможность решать те же задачи, что и органная трансплантация. Вместе с тем, эта технология намного расширяет возможности трансплантационного лечения, делая его доступным для широкого круга разных категорий пациентов.
Основой для развития новейших реконструктивных технологий являются функционирующие клетки, способные в зависимости от микроокружения формировать ткани разных типов.
Список болезней, при лечении которых клеточные технологии уже используются или их применение планируется в ближайшем будущем, быстро растет. В этот список, по-видимому, войдут все болезни, медикаментозное лечение которых малоэффективно. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых биокомпозиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом.
Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующихся материалов, которые используют в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами.
Революционные преобразования традиционных биотехнологических процессов связаны с применением методов генетической инженерии. Метод рекомбинантных ДНК является краеугольным камнем новейшей биотехнологии. Создание рекомбинантных ДНК означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов.
С помощью генетической инженерии разработаны и используются различные социально значимые технологии и процессы:
- производство новых лекарственных препаратов и безопасных вакцин;
- лечение некоторых генетических заболеваний;
- создание биоконтролирующих агентов для сельского хозяйства;
- повышение урожайности и снижение стоимости продукции;
- снижение аллергенности некоторых продуктов;
- улучшение питательных свойств продуктов;
- разработка биодеградирующих пластмасс;
- снижение уровня загрязненности воды и воздуха;
- замедление скорости порчи пищевых продуктов;
- контроль над вирусными заболеваниями.
Молекулярное, или генетическое, клонирование - процесс создания генетически идентичных молекул ДНК - является основой молекулярной биологии, фундаментальным методом биотехнологических исследований, а также основой развития и коммерциализации биотехнологии. Подавляющее большинство практических приложений биотехнологии, начиная с разработки лекарственных препаратов и заканчивая созданием трансгенных культур, основывается на методах генетического клонирования.
С помощью молекулярного клонирования стали возможными: идентификация, локализация и описание генов; создание генетических карт и секвенирование целых геномов; проведение параллелей между генами и ассоциированными с ними признаками; установление молекулярной основы проявления признаков. Область применения клонирования чрезвычайно широка.
К числу перспективных направлений биотехнологии относится модификация генома культурных растений с целью повышения урожайности и улучшения их устойчивости к вредителям и неблагоприятным условиям среды. Наибольший интерес вызывает, естественно, возможность трансформации однодольных растений (прежде всего, злаковых).
Трансформация генома высших растений реализуется двумя методами: баллистическим и с использованием природной системы переноса генетического материала - части Ti-плазмиды (Т-ДНК) - Agrobacterium tumefaciens -возбудителя бактериального рака или корончатого галла у двудольных растений. В качестве маркерной системы используют гены антибиотикоустойчивости, а также новые системы - Lux-гены или ген бактериальной Р-глюкуронидазы, вызывающий окрашивание селективной среды. Ti-плазмиды, модифицированные разными генами, переносят в растения. Перенос генетической информации с помощью Ti-плазмиды осуществлен и на примере однодольных растений: использовали ткани луковицы гладиолуса с удаленными боковыми частями.
Цилиндрические эксплантанты заражали вирулентными штаммами агробактерии, несущими Ti-плазмиду, которая содержит гены, кодирующие синтез опинов; спустя 24 ч на поверхности зараженного растения появлялись опухоли. Специалисты Карнелского университета (США) предложили новый метод - стрелять по клеткам растений вольфрамовыми пулями, покрытыми генетическим материалом. «Обстрел» клеток-хозяина происходит со скоростью свыше 1 000 км/ч миллионом металлических дробинок, покрытых слоем фрагментов ДНК; метод оказался универсальным.
С помощью генетического конструирования стало возможным получение соле-, гербецидо- и морозоустойчивых растений. По оценкам специалистов, в США ежегодный ущерб от заморозков оценивается в 6 млрд дол. Оказалось, что наиболее активными центрами кристаллизации являются отдельные бактерии (представители Pseudomonas, Erwinia), способные вызывать образование льда при 0 оС; их назвали INA-бактерии - активные кристаллизаторы воды (Ice-nucleation Active). В этих бактериях идентифицирован специфический мембранный белок, вызывающий кристаллизацию; ice-гены были клонированы и модифицированы.
Удаление средней части привело к потери способности экскретировать белок кристаллизации. В результате бактерии с модифицированным ice-геном утратили способность кристаллизовать воду при -1-5 оС. Посев этих генетически модифицированных бактерий на растения в момент распускания почек препятствует колонизации другими бактериями, поэтому растения фактически иммунны для заражения INA-бактериями дикого типа и им не страшны кратковременные заморозки.
Вторая волна «зеленой революции» ориентирована на получение генетически модифицированных «самоудобряющихся» растений. Установлено, что в составе генома азотфиксирующих симбиотических бактерий имеется группа генов, ответственных за симбиоз с растениями и локализованных в крупных симбиотических плазмидах pSym; процесс формирования клубеньков контролируют nod-гены и, наконец, nif-гены ответственны за синтез нитрогеназы, т.е. азотфиксацию.
В настоящее время большие средства в США и других странах вкладываются в программу получения трансгенных злаковых с генами азотфиксации. Однако при переносе генов азотфиксации в высшие растения, помимо трудностей генетического характера, имеются и другие. Пока не изучена в должной мере регуляция взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и кофакторов, необходимых для функционирования фермента нитрогеназы.
Последняя должна быть защищена от ингибирующего воздействия кислорода. Ведутся также интенсивные исследования генетики растений для подбора эффективных растений-хозяев, а также исследования, направленные на модификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями (например, хлебными злаками). Фундаментальные исследования по переносу генов азотфиксации в высшие растения, по-видимому, приведут к многообещающим открытиям и коренному перевороту практики азотного питания растений.
Второе, весьма важное направление применения генетической инженерии, - придание культурным растениям устойчивости к заражению листогрызущими насекомыми. Природные фитопатогены, например бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), синтезирующие токсины, эффективные против листогрызущих насекомых, стали источником генов для придания растениям устойчивости к этим вредителям. Синтез токсинов Bt контролируется одним геном, имеющиеся методы позволяют проводить работы, направленные на улучшение существующих продуцентов и продуктов Bt.
Известно, что гены, контролирующие синтез кристаллов Bt, локализованы на небольшом числе плазмид значительной молекулярной массы. Токсический белок, синтезируемый Bt, клонирован в E. coli и B. subtilis, его экспрессия получена даже в течение вегетативной фазы роста. Есть сведения о клонировании белка, токсичного для бабочек, в клетках табака.
В выросшем целом растении табака каждая клетка вырабатывала токсин. Таким образом, растение, приобретшее токсин, само становится устойчивым к насекомым: поедая листья, гусеница погибает, не причинив существенного вреда растению.
Американскими компаниями «Монсанто» и «Агроцетус» проведены полевые испытания и районированы сорта хлопчатника, сои и ряда других культур с внедренным в хромосому геномом Bt. Резистентность к гусеницам передается семенам и последующим поколениям растений. Начато получение рассады трансгенного картофеля и томатов с внедренным геном Bt, токсичного для чешуекрылых. Создан трансгенный инсектоустойчивый тополь с внедренным геном антитрипсиназы в клетки тканей. Фермент снижает усвоение белка насекомыми, что приводит к сокращению популяции.
Клонированы гены устойчивости к гербицидам; их клонирование в растения призвано обеспечить безопасность применения ядохимикатов в сельском хозяйстве. Однако клонирование генов в культурные растения сопряжено с определенным риском. Опасения связаны с возможностями выхода генетических векторов и трансгенных растений из-под контроля биотехнологов. Поэтому высказываются опасения превращения генно-инженерных растений в сорняки, хотя комплекс «сорняковости» (комплекс признаков, обеспечивающих быстрое распространение в ущерб культурным растениям, устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, эффективные механизмы рассеивания семян и пр.) едва ли может сформироваться в результате трансплантации одного или немногих генов.
В то же время устойчивость к гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к некоторому препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду. Это предусматривает необходимость тщательного тестирования всех генно-инженерных растений перед их переносом в полевые условия.
Новый путь модификации генома - применение антисмысловых РНК, т.е. подавление синтеза определенного белка. Введение в клетку комплементарного олигонуклеотида мРНК препятствует считыванию информации. Использование данной технологии позволило получить сорт томатов, сохраняющихся длительное время за счет блокирования функции гена полигалактуроназы (расщепляет углеводы в клетке, стимулируя созревание), или кофе с низким уровнем кофеина в результате введения гена, подавляющего продукцию; т.е. это путь удаления неприятных горьких и прочих веществ из сельскохозяйственной продукции, подавления вирусных инфекций и т.д.
Генетическая инженерия животных направлена на выведение животных с высокими эксплуатационными свойствами.
Методы генетической инженерии совместно с методом клонирования животных позволяют также получать модели для изучения заболеваний человека, процессов старения и формирования злокачественных новообразований. В будущем эти приемы могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и оценки эффективности таких методов лечения, как генная и клеточная терапии. Клонирование животных также предоставляет возможность спасения видов, находящихся под угрозой вымирания.
К биотехнологическим методам репродукции животных относятся искусственное осеменение, индукция родов, трансплантация, регулирование соотношения особей мужского и женского рода в популяции, это также ранняя диагностика беременности, применение гормонов для регулирования репродуктивных функций и роста и пр.
Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом клонирования. Метод дает возможность получения большого числа копий животных от высокоценных производителей. Возможно получение большого числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые оболочки яйцеклеток свиньи, помещают в агаровые цилиндры на несколько дней, далее вводят в яйцеводы овец.
Нормально развившиеся зародыши пересаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полового цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок -ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рождение. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетически абсолютно идентичными.
Манипуляции на эмбрионах используют для получения эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овцекозлиные химеры.
Первые эксперименты показали возможность трансформации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней, несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется в составе молока.
Новый метод - перенос ядра соматической клетки (или перепрограммирование яйцеклеток) начинается с выделения из организма соматической клетки - любой клетки, не участвующей в процессе репродукции (т.е. любой, кроме половых клеток - сперматозоидов и яйцеклеток). У млекопитающих любая соматическая клетка содержит полный двойной набор хромосом (в каждой паре одна хромосома получена от материнской яйцеклетки, вторая - от отцовского сперматозоида). Геном любой половой клетки состоит только из одного хромосомного набора.
Для создания овцы Долли исследователи переместили ядро соматической клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой было предварительно удалено. После проведения определенных химических манипуляций яйцеклетка с подмененным ядром начала вести себя как свежеоплодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион, который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение полного срока беременности. Появление Долли продемонстрировало возможность удаления генетической программы ядра специализированной соматической клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях методом помещения в яйцеклетку.
В течение 5-6 дней яйцеклетка развивается в эмбрион, генетически идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть использованы для получения любого типа ткани, которая при пересадке не будет отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть использован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Данный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее время.
Совершенствование биотехнологических методов и средств диагностики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффективные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений -все это способствует повышению качества жизни человека.
Ощутим вклад биотехнологии в увеличение ресурсов минерального сырья и энергоносителей, а также в охрану окружающей среды. В связи с последним особо значимым становится направление, ориентированное на освоение экологически чистых новых материалов. Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. К настоящему моменту объемы выпуска не разрушаемых в природной среде синтетических пластмасс достигли 180 млн т/год, что создало глобальную экологическую проблему.
Радикальным решением этой проблемы является освоение полимеров, способных биодеградировать на безвредные для живой и неживой природы компоненты. В этой связи в последние годы наметился существенный прогресс в области синтеза разрушаемых биополимеров - высокомолекулярных полимерных материалов, способных деградировать в природной среде до безвредных продуктов (диоксида углерода и воды).
Н.А. Воинов, Т.Г. Волова